Osteoimmunology

はじめに

骨と免疫は、近くて遠い関係にある。免疫系は感染防御のために存在するが、骨格系は身体支持や運動機能を司どり、機能的には全く相入れない関係にあるように見える。しかし、免疫細胞が分化増殖する造血の場は骨髄にあり、 その意味では免疫と骨は表裏一体のものである、という意味である。
多くの制御因子を共有している上に、共通の微小環境で分化増殖するため、免疫系細胞は、サイトカイン産生や細胞膜上の分子を介して骨格系細胞の分化や機能制御に深く関与する。 このため、生体防御に伴う免疫応答や自己免疫疾患による免疫系の異常な活性化は、骨代謝に直接影響を及ぼすことになる。しかし、免疫系と骨代謝の研究はそれぞれ別個の分野として研究が行われてきており、 その相互作用が正面から研究対象とされることはまれであった。ところが、近年、関節リウマチ(RA)や歯周病などの疾患において、炎症や感染が骨破壊を引き起こすメカニズムの研究が進展するにつれて、 免疫系による骨代謝制御の重要性が認められるようになってきた。また、免疫制御分子の遺伝子改変動物の解析から、意外な分子が骨代謝制御に関与することが明らかになり、骨格系と免疫系の研究が接近してきたのである。


I. 骨と免疫を結ぶサイトカインRANKLとその制御系

免疫系と骨代謝をつなぐことになった最も重要な発見は、破骨細胞分化因子RANKL(receptor activator of NF-κB ligand)の同定であった。 RANKLは、YasudaらおよびPenningerらのグループによって破骨細胞の分化を制御する中心的なサイトカインであることが報告されたが^1,2、 すでにT細胞上に発現する樹状細胞活性化因子としてクローニングされていた分子であった。RANKLに対してTRANCE (TNF-related activation-induced cytokine)という呼称を今も使用しているChoiらも、 免疫系の研究からこの分子を発見したグループの一つであり³、彼らが2000年にはじめてNature誌上でosteoimmunology (オステオイミュノロジー：骨免疫学)という言葉を用いてこの分野の研究を位置づけた⁴。 Choiらは、RANKL/TRANCEの破骨細胞における研究だけでなく、免疫系での制御に関する研究も続けており、この分野を強力に推進している研究グループの一つである。 また、RANKLおよびその受容体であるRANK、阻害受容体であるosteoprotegerin (OPG)の欠損マウスを精力的に解析したPenningerらのグループは、欠損マウスを用いてRANKLがリンパ節形成やリンパ球分化、 さらには乳腺形成に必須であることを明らかにした。彼らも最近osteoimmunologyというキーワードで総説を著し、その厖大な成果をまとめている⁵。
このように、RANKLを中心とした研究から免疫系と骨代謝の密接な関係に光があたるようになってきている。しかし、骨代謝と免疫系の密接な関係はさらに広い範囲で明らかにされつつある。 日本でもレミケードをはじめとするTNF-αを抑制する生物製剤がリウマチ治療に導入され、骨破壊抑制効果が脚光を浴びていることも一例である⁶。 また、われわれは、免疫系の制御因子として重要と考えられてきたインターフェロン（IFN）系がRANKLシグナルの制御に重要な役割を果たすことを明らかにし^7,8、 活性化T細胞におけるサイトカイン産生で重要と考えられてきた転写因子NFATc1が破骨細胞分化で非常に重要な役割を果たすことや⁹。、 IFN系の細胞内シグナル伝達で重要と考えられてきた転写因子Stat1に骨形成抑制機能があることを見いだした¹⁰。
最近では、破骨細胞分化に必須なRANKLとM-CSF以外の第三のシグナル系にも免疫受容体が関与するという驚くべき知見が得られており¹¹、 免疫系制御分子による骨代謝制御の分野は、今後さらなる発展が期待される分野となってきた。ここでは、骨と免疫の境界領域である骨免疫学に焦点をあてて解説する。


II.関節リウマチ(RA)における破骨細胞形成のメカニズム

活動期のRA滑膜は腫瘍様に増殖し、周囲の組織を破壊していく。RA滑膜細胞は形態的変化や、異常な増殖活性を示すため、しばしば「腫瘍様」と形容されるが、 実際は、T細胞性の免疫反応が過剰な生体反応を引き起こした結果、滑膜細胞の細胞内情報伝達系が異常に活性化している状態と考えられる。 増殖や炎症性メディエーターの転写に関与するさまざまな刺激伝達系路の活性化が知られ、特にMAPK系のキナーゼカスケードやNF-κB, AP-1等の転写因子の活性化が報告されている¹²。 その結果、炎症性・骨吸収性サイトカイン（IL-1, IL-6, TNF-α）、増殖因子（FGF-2, PDGF）等の産生が亢進し、MMP（マトリックスメタロプロテアーゼ）やカテプシンなどの基質分解酵素の産生が誘導される。 このような活性化した滑膜細胞の増殖と過剰な炎症性サイトカインが、骨破壊の基礎的病態を形成する。

RA患者の骨破壊部において、増殖した滑膜が、骨内へと侵入していく最前線を病理学的に検討すると、多数の多核巨細胞が観察される。この細胞は、酒石酸耐性酸フォスファターゼ（TRAP）染色陽性で、 破骨細胞としての表現型をみたすことが明らかになっており、リウマチ骨破壊において破骨細胞が重要な役割を果たしていることが推察される。 破骨細胞は、マクロファージ・単球系前駆細胞 が骨芽細胞・ストローマ細胞等の形成支持細胞との接触刺激を受けて形成される。 我々は、RA滑膜細胞培養系をもちいて、滑膜マクロファージが滑膜線維芽細胞の支持のもとで破骨細胞に分化することから、滑膜線維芽細胞は、破骨細胞形成に必要な微小環境を整えて破骨細胞形成を促進し、 骨破壊に関与していることを明らかにした¹³。つまり、RA滑膜組織は、破骨細胞の前駆細胞（滑膜マクロファージ）、 形成支持細胞（RANKL陽性の滑膜線維芽細胞）、誘導因子・活性化因子（IL-1, IL-6, TNF）がすべて共存しているために、非常に効率よく破骨細胞を形成する組織であると考えられる。


III.破骨細胞がなければ炎症がおきても骨は壊れない

破骨細胞による骨吸収が炎症性骨破壊に必須であることを示す証拠はあるのだろうか。決定的な証拠となるのは、破骨細胞が存在しないマウスに関節炎をひきおこしても骨破壊が生じないという報告である。Gravalleseらは、 RANKL欠損マウスにおいて血清移入による関節炎を引き起こしても骨破壊が起こらないことを報告した¹⁴。また、骨破壊性関節炎を自然発症するTNF-αトランスジェニックマウスとc-fos欠損マウスを交配した場合、 炎症はおこるが骨破壊はおこらないことが報告された¹⁵。
破骨細胞の重要性を示すもう一つの知見は、破骨細胞を標的とした治療が骨破壊を抑制できるとする報告である。 われわれは、破骨細胞機能を抑制するためにc-Srcの活性を抑制するcsk遺伝子を導入することでアジュバント関節炎で骨破壊を制御できることを報告した¹⁶。 また、Penningerらは、破骨細胞分化抑制因子OPGをアジュバント関節炎に投与して骨破壊抑制が見られたと報告した¹⁷。最近、ビスフォスフォネートによる骨破壊抑制効果も報告されており、 これらの報告を総合すると、リウマチ骨破壊の主役は破骨細胞であり、破骨細胞がなけれが炎症は起きても骨は壊れないと結論して良いと考えられる。


図1

























IV. 破骨細胞分化の必須因子RANKL
破骨細胞は骨髄単球/マクロファージ系の前駆細胞に由来しており、骨芽細胞や骨髄ストローマ細胞などの破骨細胞分化を支持する間葉系細胞との細胞間接触によって分化が誘導される。 まず、支持細胞から産生される破骨細胞分化に必須の因子として同定された因子は、macrophage colony-stimulating factor (M-CSF)であった。M-CSFの欠損は、 Bcl-2の過剰発現によりレスキューされることから、分化を推進する作用よりも、前駆細胞の生存因子としての役割が中心であると考えられている¹⁸。

骨芽細胞等の破骨細胞形成支持細胞に発現する破骨細胞分化因子ODF　(osteoclast differentiation factor)が同定されたのは1998年であった^5,19。 この分子は、すでにTリンパ球上に発現するdendritic cell活性化因子として報告されていたRANKLと同一の分子であった²⁰。RANKLはTNFリガンドファミリーに属する膜貫通型タンパクであり、 受容体であるRANKと結合して細胞内にシグナルを伝える。RANKL-RANKシグナルは、ノックアウトマウスの所見から、破骨細胞分化の必須因子であること、リンパ節形成やリンパ球分化に重要な役割をもつことが明らかにされた⁵。 RANKLは、活性型ビタミンＤ₃、PGE₂、副甲状腺ホルモンPTH、IL-6などのこれまで知られてきた多くの骨吸収因子によって骨芽細胞などの破骨細胞形成支持細胞の表面上に誘導されることが明らかにされた（図1）。 さらに、RANKL欠損マウスにおいては、これらの因子の骨吸収促進作用が消失することから、RANKLシグナルが生体における骨吸収レベルを最終的に決定する重要な役割を果たすことが示された⁵。


V.　RANKLによって活性化される細胞内シグナル伝達経路

このようにRANKLは破骨細胞性骨吸収のレベルを決定する中心的な因子であることから、その細胞内シグナル伝達は、分化のメカニズムの解明と治療標的の同定の両方の意味で非常に注目を集めることとなった。 RANKL受容体であるRANKに会合する因子が精力的に解析され、TNF receptor-associated factor (TRAF) ファミリーのアダプター分子の多くが結合することが明らかになった。その中で、最も重要な分子は、 ノックアウトマウスが大理石骨病になるTRAF6 (TNF受容体関連因子６)と考えられる^21,22。

TRAF6は、リングフィンガーとジンクフィンガーをもつタンパクで、RANKL刺激により、RANKと結合して３量体を形成してNF-κB, JNK, p38などの下流分子を活性化する（図1）。TRAF6欠損マウスは、 ２つのグループから発表されており、大理石骨病の原因に関して議論が分かれていた。すなわち、活性異常が原因なのか分化異常が原因なのかで意見が分かれていた^21,22。 しかし、TRAF6の各ドメインの分化や下流シグナルの制御への関与がレトロウイルスベクターを用いたレスキュー実験で詳細に検討され²³、TRAF6のレベルが分化制御で重要な位置をしめることが次第に明らかになり⁷ 、 現在では、TRAF6は分化において必須であると考えられるようになった²⁴。

TRAF6の下流で活性化される分子は、NF-κB, TAK1, JNK, p38, ERK、PI3K/Aktなどが知られている¹⁸。しかし、これらの分子群の中で、遺伝学的な手法でその必須性が証明された分子は、 NF-κBだけである。他の分子に関しては、今のところ阻害剤やドミナントネガティブ分子の過剰発現系などで重要性が確認されてきており、さらに遺伝子欠損細胞等を用いた詳細な検討が期待されている。


VI. 破骨細胞分化のマスターレギュレーターNFATc1の同定

NF-κB p50/p52 ダブルノックアウトマウスのほかにも、いくつかの転写因子の欠損や変異が、破骨細胞分化障害に伴う大理石骨病を呈することが知られている。 RANKLは転写因子複合体AP-1の構成分子であるc-Fosを誘導し、AP-1を活性化することが明らかになっていが⁸、この経路の重要性は、c-fosノックアウトマウスが破骨細胞を欠損していることで証明されている。 このほかに、PU.1ノックアウト、miマウスなどが大理石骨病を呈することが知られており、PU.1やMITF等の転写因子が破骨細胞分化に必須であることが明らかになっている¹⁸。これらの転写因子は、 協調して酒石酸耐性酸ファスファターゼ（TRAP）やcathepsin K遺伝子などの破骨細胞特異的遺伝子のプロモータを制御することが示されているが、RANKLシグナルによって活性化される既知の経路とどのように関連するのかの詳細はほとんど明らかになっていない。
NFAT（nuclear factor of activated T cells)といえば、その名の通り、活性化T細胞におけるサイトカイン産生で重要な役割を果たす転写因子だと考えられてきた。ところが、RANKL標的遺伝子スクリーニングの過程で意外な結果が得られた。 NFATファミリーの中でNFATc1分子がRANKLによって特異的に誘導され、そのmRNA量は刺激前の20倍以上に増加することがわかったのである。NFATc1は破骨細胞分化の過程において活性化し、核に集積し転写活性化しており、生体内においてもNFATc1はTRAP陽性の破骨細胞において強発現していることが明らかになった。RANKLによるNFATc1の活性化は、カルシウム依存性の脱リン酸化酵素であるカルシニューリンを介しており、この抑制剤であるFK506 やサイクロスポリンAは破骨細胞分化をを強力に抑制することも見いだされた。さらに重要な知見として、NFATc1を欠損したES細胞は、破骨細胞分化が完全に障害されていたことが明らかになり、NFATc1は破骨細胞分化に必須の転写因子であり、RANKLシグナル伝達の中心的な役割を担うことが示された⁹（図1）。


VII.　NFATc1を標的とした炎症性骨破壊治療の可能性

既存の抗リウマチ薬から破骨細胞分化抑制効果の強い薬剤を選択し、その作用機序を検討したところ、ピリミジン合成抑制効果をもつ免疫抑制剤として知られ、 臨床的に骨破壊抑制効果をもつleflunomideが破骨細胞分化を強く抑制することが明らかになった。また、leflunomide存在下では、RANKLによるNFATc1発現が特異的に抑制されており、 骨破壊抑制効果とNFATc1発現抑制効果が結びついていることが明らかになった²⁵。さらに生体レベルでも破骨細胞への直接作用が、抗リウマチ薬の骨破壊抑制する効果に重要であることを示唆するデータがえられてきており、 NFATc1がリウマチ骨破壊の治療標的として有望であることを示唆している。さらに、リウマチ患者の骨破壊部の病理組織を検討した結果、骨破壊部の破骨細胞に一致して強いNFATc1の発現が確認された。 今後、NFATc1を標的としたRANKLシグナルの特異的な制御法が開発できれば、破骨細胞を効率良く制御するRA治療薬の開発へ道を開く可能性がある。


VIII.　破骨細胞分化に必須の第三の受容体群とITAMシグナル

図2
破骨細胞分化において、カルシウムシグナル依存性に誘導されるNFATc1がマスター転写因子であることが明らかになったが、NFATc1活性化に必要なカルシウムシグナルの活性化がどのようなメカニズムで誘導されるのかは不明であった。 RANKのようなTNFファミリーの受容体が直接カルシウムシグナルを活性化することは考えにくかったからである。 われわれは、ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation motif)をもつアダプター分子であるDAP12 (DNAX activating protein 12) の欠損細胞において破骨細胞分化の異常があることから²⁶、免疫細胞でカルシウムシグナルを活性化するITAM が破骨細胞分化においても重要な役割をもつ可能性があるのではないかと考えた。
DAP12欠損マウスの骨髄細胞はin vitroでは破骨細胞分化が障害されているが、 骨芽細胞との共存培養では分化がレスキューされ、マウスの生体レベルでも正常数の破骨細胞が観察されることから²⁶、in vivoにおいてはDAP12の機能は他の分子によって代償されていることが予想された。 われわれは、以下の理由からFc receptor common γ subunit (FcRγ)が代償分子と予想した。

1.レスキューする受容体の候補となるosteoclast-associated receptor (OSCAR)²⁷がFcRγ 会合性受容体であったこと。 2.破骨細胞前駆細胞のDNAチップを用いた発現解析から、ITAMをもつアダプター分子の中で、DAP12の次に高発現するのはFcRγ であること。 そこで、DAP12とFcRγ のダブル欠損マウス(DKO)を作成した¹¹。DKOは、in vitroでもin vivoでもほぼ完全に破骨細胞分化が障害され、 骨髄腔が形成されない重篤な大理石骨病を呈した。DKO由来の破骨細胞前駆細胞にレトロウイルスでDAP12を発現させると、野生型（WT）のDAP12では効率よくレスキューされるが、 ITAMのリン酸化部位に変異を入れたDAP12においては、レスキューされないことから、破骨細胞分化においてITAMを介したシグナルが重要な意義をもつことが示された。DAP12とFcRγ は、 単独では細胞膜上に発現できない免疫受容体と会合することで、その受容体の膜上での発現を誘導するとともに、受容体からのシグナルをITAMを介して下流に伝えるアダプター分子である。それでは、 破骨細胞前駆細胞においてFcRγ及びDAP12に会合する受容体は何なのであろうか？われわれはOSCAR、paired immunoglobulin-like receptor (PIR)-A、及びtriggering receptor expressed by myeloid cells (TREM)-2、 signal-regulatory protein (SIRP)β1といった免疫グロブリン様受容体がそれぞれFcRγ及びDAP12と会合することを同定し、それらの受容体を抗体により架橋刺激すると破骨細胞分化が促進することを明らかにした。 FcRγおよびDAP12のITAMは免疫受容体とRANKLの両方に依存してリン酸化され、phospholipase C(PLC)γを介してCa²⁺シグナルを活性化することでNFATc1を誘導する。 このように、免疫受容体がDAP12またはFcRγのITAMを介して伝えるシグナルは、RANKLの共刺激シグナルとして破骨細胞分化に必須であることが解明された（図２）。


IX.　サイトカインとRANKLシグナルのクロストーク

炎症部位で主に活性化マクロファージから産生されるサイトカインであるIL-1, TNF-α, IL-6は著明な破骨細胞性骨吸収の促進作用をもち^18,19、骨吸収性サイトカインとも呼ばれる。 IL-1受容体からのシグナルは、TRAF6を活性化するため、破骨細胞前駆細胞に直接作用してRANKLシグナルを促進することは理解しやすい。ただし、IL-1は単独での破骨細胞誘導能はなく、成熟破骨細胞の活性化作用が強い。また、IL-1は、骨芽細胞・ストローマ細胞に作用してPGE2産生を介してRANKL発現を誘導するため、間接的な分化促進作用も強力である。

一方、TNF-αは、RANKLと同じファミリーの分子であり、その受容体はTRAF2を介してNF-κBやJNKを活性化する。TNF-αは前駆細胞に直接作用したり、支持細胞のRANKL発現を誘導することで、破骨細胞分化を強力に促進する。TNF-αが培養系においてRANK非依存性に単独で破骨細胞分化を誘導できるのかどうかに関しては議論があったが²⁸、最近になり、RANK^-/-マウスとTNF-αトランスジェニックマウスを交配しても大理石骨病は改善しないことが示され²⁹、現在のところRANK非依存性の破骨細胞分化経路は生体レベルでは存在しないと考えざるをえない。ただし、TNF-αは強力にRANKL発現を誘導すると同時にRANKL作用を増強する破骨細胞性骨吸収の促進因子であることから、種々の炎症性骨破壊における臨床的意義は大きい。特に、リウマチ治療においては、レミケード等の抗TNF-α療法が炎症抑制とは独立して骨破壊抑制効果をもつことからも注目を集めており、今後その骨破壊への作用機序の詳細を明らかにすることが、効率良い治療へと道を開くことと予想される。


主要なT細胞サイトカインであるIFN-γやIL-4は、ともに破骨細胞分化を抑制する。また、Th1分化を誘導するIL-12やIL-18も破骨細胞分化を抑制する。一方、T細胞は、RANKLを発現し、 可溶性RANKLを分泌することも知られており、T細胞が産生するIL-17は滑膜細胞のRANKL発現を誘導する⁵。T細胞の破骨細胞分化への作用は、生体レベルではさまざまな要因によって影響を受け、 その制御の異常が関節炎などの病態につながっている。

X.T細胞による破骨細胞分化制御

図3
すでに述べたように、筆者らは、RAの滑膜細胞培養系において破骨細胞形成が誘導されることを見いだし¹³、この系における破骨細胞分化の促進機構を検討した。その結果、 炎症組織において多量に存在するIL-1, TNF-α等の炎症性サイトカインが、滑膜線維芽細胞上に多量のRANKLを誘導し、これが滑膜での破骨細胞形成異常の原因として重要であることを明らかにした³⁰。 このように、滑膜線維芽細胞上のRANKLを重視していたわれわれの考え方とは異って、Penningerらは、活性化T細胞上に誘導されたRANKLが直接、破骨細胞前駆細胞に作用して破骨細胞分化を誘導するという説を提唱した¹⁷。 彼らは、ホルマリン固定したT細胞を用いてin vitroでの破骨細胞分化誘導能を示したが、われわれはT細胞の産生するサイトカインの作用を考慮に入れて、T細胞による破骨細胞分化制御の解析をすすめた。 そして、固定していない活性化T細胞を破骨細胞形成系に共存培養した結果、意外にも破骨細胞分化を強く抑制することを見いだした⁷。これは、T細胞が産生するIFN-γによる作用であった。 さらに、IFN-γ受容体欠損マウスを用いた検討によって、T細胞の破骨細胞分化への作用は、RANKLとIFN-γのバランスによって決定されることを解明した。活性化T細胞はRANKLを発現するが、通常はIFN-γによるRANKL抑制作用 によって、破骨細胞を誘導しないように負に制御されていたのである。RAでは、この防御機構が破綻してRANKL過剰状態に至ることで骨破壊が生じていたと考えるとうまく病態を説明できる（図１左上、図3）。 Penningerらの最新の総説においては、リウマチ骨破壊におけるRANKL供給源として、当初彼らが考えていたT細胞だけでなく、滑膜線維芽細胞・骨芽細胞のような間葉系細胞の関与にも言及されている点が注目される⁵。 滑膜線維芽細胞の発現するRANKLとT細胞の発現するRANKLが相乗効果で骨破壊を推進するが、主要なRANKL供給源は滑膜細胞であると考えるのが妥当なのであろう。

おわりに

RANKL-RANKの発見以降、破骨細胞分化制御機構の研究は急速に進歩した。しかし、破骨細胞分化の制御はRANKLのみによるものではなかった。 分化のマスター転写因子であるNFATc1の同定によってカルシウムシグナルの重要性が明らかとなり、ITAMシグナルの必須性が発見された。 今後、これらのITAMアダプター会合性受容体の制御機構が解明されれば、骨疾患の病態解明や治療応用へと道が開ける可能性がある。 多くの免疫細胞の制御に関与することが知られているITAMシグナルが破骨細胞においても重要な意義をもつことが明らかになり、 今後さらに免疫学と骨代謝学の融合領域の発展が期待される^4,31。骨免疫学が、骨代謝学と免疫学に新たな視点を提供し、骨疾患や免疫疾患の新規治療戦略が生まれることを期待したい。


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